1. IntroductionType 1 diabetes mellitus is an organ-specific  autoimmune disease characterized by T cell-mediated destruction of pancreatic β cells   Humoral autoimmunity directed towards islet cell antigens in type 1 diabetes mellitus has been studied extensively. Islet cell antibodies (ICA) were the first identified [1,2],  followed by insulin autoantibodies (IAA) [3]. Antibodies  to two isoforms of GAD with molecular  weights 65,000 kDa (GAD65) and 67,000  kDa (GAD67)  have been also identified [2,3]. The smaller molecular  weight antigen, GAD65, is the predominant  form found in human islets of pancreas [5] and  has been shown to be the major target of antibodies  in human diabetes mellitus [5, 6]. GAD antibodies   may be an attractive marker for the prediction and diagnosis of diabetes because longitudinal  studies have revealed little change in levels of GAD65 antibodies before and after the onset of  diabetes [7,8]. Eiji et al. (2003) reported that the prevalence of the frequency of GAD autoantibodies was from 34% of those aged 25-35 at diagnosis to 7% of those aged 55-65. Circulating antibodies to glutamic acid decarboxylase (GADab) are a major indicator for autoimmune destruction  of pancreatic islet cells (type 1 diabetes). 2. Experimental methodTo produce MAb-h-GAD₆₅ abs  immunization was carried out using single protein band of autoantibody GAD₆₅ collected  from type 1 diabetic patients sera. The preparation of autoantibody GAD₆₅ were collected by SDS-PAGE technique. The human autoantibody GAD₆₅ as antigen was  injected intraperitoneally into two female BALB/c mice. After 3 weeks the animals received ‘booster’ doses twice with autoantibody GAD₆₅  (at 1-week intervals), after which the spleen cells were prepared and fused with an exponentially growing NS0 myeloma cell line using polyethylene glycol [6]. After 2 weeks in selection medium and isolation of positive cells, and were cloned to select hybridomas with a high mAb production. The cells producing the most mAb were used to prepare large quantities of mAb, purified through a Sephadex G25 column [6]. The purified mAb was used in different  technique (Dot blot, Weatern Blot and ELISA)  after establishing the appropriate dilution. 

Dot blot

Dot blots were carried out as described by Aulanni’am.[2005]; 3 cm² Nitrocelllulose  membranes (NC) were cut and activated in PBS  and   10 µL of  autoantibody GAD₆₅ (10 µL/dot) was coated in NC  and allowed to bind. The papers were incubated 2 hours in blocking buffer containing 5% (w/v) milk powder in PBS. They were washed three times in PBS-T and incubated with primary antibody for 1 h. After three washes in PBS-T with and without 0.05% Tween-20 the membranes were incubated with 1/750 dilution rabbit antimouse alkalin phosphatase conjugate (Sigma) for 1 h. After further washes, they were exposed toalkalin phosphatase substrate consisting of 0.21 mg/mL Nitro Blue Tetrazolium and 0.42 mg/mL Bromo- 4-chloro-3-indoxyl-phosphate in Tris buffer. The reaction was terminated by rinsing with fresh water.

SDS-PAGE and Western blotting

Standard methods of SDS-PAGE and Western blotting were used [6]. The resolving gel was set at 12% (v/v) concentration, and isolate autoantibody GAD volume 35 µL/lane was loaded and run at a constant current of 10 mA. The transfer was attained at a constant current of 150 mA for overnight to NC membrane. After transfer the membrane was washed in PBS + NaN₃ and immersed in 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT) substrate buffer to develop the band patterns.

3. Results and discussion

Spleen cells were collected form rats that induced by human autoantibodies  GAD65 from type 1 diabetic patients.  For preparing hybridoma cells that  produce MAb-h-GAD65 abs, we used Myeloma cell NS0 collected from PUSVETMA, Surabaya.       Cell fusion produced 98 hybridomas and on screening these, 15 were selected with the following positive profile when tested using ELISA technique. Supernatant from one cell population producing clones was purified, the trapped MAb eluted and collected fractions tested. Fraction Mab showed the maximum protein concentration (as measured by the optical density at 280 nm) and maximum antibody activity, as tested by dot blot assay Using a sera prepared from type 1 diabetic  patients  as an immunogen were positively reacted with our product, namely MAb-h-GAD65-abs conjugated by Alkaline Phosphatase (AP).   Analysis of its molecular weight corfirmed by SDS-PAGE and titre of MAb-h-GAD65-abs measured by ELISA reader. We have developed a simple, reproducible and rapid method to detect GAD₆₅ human autoantibodies using MAb-h-GAD65 abs Alkali Phosphatase conjugated that confirmed by western blot technique Using this MAb-h-GAD₆₅ abs resulted by this study, 85 % of serum samples from diagnosed IDDM patients were positive for GAD₆₅ autoantibodies, thereby showing that the positive rate of this method is comparable to that found in IDDM by other researchers using human rec GAD₆₅ kit and shows a high specificity 92%. In addition, using Mab-h-GAD₆₅ abs, by Western blot technique, we demonstrated  that  Mab-h-GAD₆₅  conjugated by alkaline phosphate positively reacted  with sera type 1 diabetic patients.  4. Conclusions In conclusion, these results suggest that our result will be useful for detecting anti-GAD65 autoantibodies. It can be used in preclinical IDDM designed to evaluate the predictive value of GAD65 autoantibodies, if necessary in combination with other metabolic, genetic and immunological disease markers. Acknowledgements This Study was supported by INSENTIF Funding From MENRISTEK; We thank also to Dr. Uun Yanuhar for skillful technical assistance of culture hybridoma cell. References1.   Lohmann, T.,Kellner K. and Verlohren V.J. . 2001. Titre and combination of ICA and autoantibodies to glutamic acid decarboxylase discriminate two clinically distinct types of latent autoimmune diabetes in adults (LADA). Diabetologia 44: 1005–1010. 2.   Eiji K., N. Abiru, F.Sun., T.Fukushuma, R. Takahashi, H. Kuwahara, N. Fujita,  A. Kita, K. Oshima, S. Uotani, H. Yamasaki, Y. Yamaguchi,  and K.Eguchi. 2003. Epitope Analysis of GAD65 Autoantibodies in Japanese Patients with Autoimmune Diabetes. Annal of The New York Academy of Sciences 1005 (1), 440-4483.   Juneja, R., I.B. Hirsch, R.G. Naik, et al. 2001. Islet cell antibodies and glutamic acid decarboxylase antibodies, but not the clinical phenotype, help to identify type 1(1/2) diabetes in patients presenting with type 2 diabetes. Metabolism 50: 1008–1013. 4.   Petersen, J.S., K.R. Hejnaes, A. Moody, et al. 1994. Detection of GAD65 antibodies in diabetes and other autoimmune diseases using a simple radioligand assay. Diabetes 43: 459–467.5.   Soeatmadji DW., Aulanni’am and Sumitro, SB.  2005. Detection  of  GAD65 Autoantibodies of Type 1 Diabetes Using Anti-GAD65 abs Reagent Produced  From Bovine Brain. Medical Journal of Indonesia Vol 14 ,No.  4 Desember 2005.6.   Aulanni’am, Soeatmadji DW. and Sumitro, SB.  2006. Monoclonal Antibodies Againts Human GAD₆5 Autoantibodies   (Mab-h-GAD₆₅ abs). Presented at Nasional Seminar PERKENI,  Batu, July, 20077.   Birch, J.R., J. Bonnerjea, S. Flatman, and S. Vranch (1995). The production of monoclonal antibodies. In: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications J.R. Birch and E.S. Lennox, eds., Wiley Liss, Inc.: New York, NY, pp. 231-265, ISBN:0-471-05147-0.8.   Bog-Hansen, T.C. (1995). Separation of monoclonal antibodies from cell-culture supernatants and ascites fluid using thiophilic agarose. Methods in Molecular Biology 45:177-81, ISSN:1064-3745.9.   Davis, W.C. (1995). Methods in Molecular Biology, Vol. 45. Monoclonal antibody protocols. Humana Press Inc.: Totowa, NJ, USA, 264p., ISBN:0-89603-308-2.

Pendahuluan

Penggunaan obat tradisional  merupakan warisan turun temurun dari nenek moyang kita  dan  keberadaannya terkait dengan budaya bangsa Indonesia.  Beberapa obat yang sekarang digunakanpun  berbasis dari herbal atau satu kandungannya adalah berasal dari tanaman, diantarnya diperoleh melalui proses ekstraksi atau sintesis meniru komponen yang terkandung dari tanaman. Indonesia termasuk salah satu negara “megadiversity” yang kaya akan keanekaragaman hayati.  Oleh karena setiap spesies tumbuhan, hewan, dan mikro-organisme mempunyai nilai-nilai kimiawi  dalam menghasilkan senyawa kimia yang banyak  ragam dan  jumlahnya, maka keanekaragaman hayati (biodiversity) yang tersedia di Indonesia dapat diartikan sebagai sumber senyawa kimia bahan alam yang sangat beranekaragam (chemodiversity).  Dalam sejarah perkembangannya, bangsa Indonesia telah banyak meramu  ramuan obat dan melakukan pengobatan secara tradisional, yang juga menjadi bagian penting penemuan beberapa jenis obat.  Namun  dilain pihak seringkali kepedulian terhadap sejarah  tersebut diabaikan sehingga banyak bukti peninggalan yang tidak terdokumentasi dengan baik,   banyak yang hilang begitu saja dan bahkan menjadi temuan yang mendapat patent  internasional dari penemu bukan bangsa Indonesia.Menurut definisi Departemen Kesehatan RI obat tradisional  didefinisikan  sebagai  obat jadi atau ramuan bahan alam yang berasal dari tumbuhan, hewan, mineral,  dan campuran bahan tersebut yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman.  Namun  kenyataannya bahan obat tradisional yang berasal dari tanaman  porsinya lebih besar dibandingkan yang berasal dari hewan atau mineral, sehingga sebutan untuk obat tradisional hampir selalu identik dengan tanaman obat karena sebagian besar obat tradisional bahan bakunya berasal dari tanaman obat. Perkembangan ilmu pengetahuan terhadap pengobatan berbasis bioaktif asal tanamam mengalami peningkatan yang pesat. Makin banyak peneliti yang melakukan eksplorasi terhadap  tanaman obat  untuk mengetahui berbagai macam kandungan di dalamnya  dan manfaatnya bagi peningkatan kualitas peradaban/kehidupan manusia.    Sampai saat ini sudah banyak tanaman obat terbukti secara empiris dalam mengobati penyakit.  Penemuan tanaman obat yang menunjukkan efek farmakologis terhadap  beberapa penyakit, seperti  diabetes mellitus, hipercholesterolemia, rhematoid artritis, kelainan fungsi hati, kanker dan juga antifertilitas  mendorong beberapa peneliti untuk melakukan eksplorasi bahan bioaktif dari tanaman obat tersebut.  Untuk kepentingan hal ini  uji praskrining sampai dengan  uji  in vitro dan in vivo untuk mengetahui peran bioaktif  yang dikandungnya. Namun beberapa penelitian  yang sudah dilakukan belum jelas menjawab mekanisme kerja obat tersebut berkaitan dengan patomekanisme penyakit yang sangat kompleks, selain itu juga disebabkan pengunaan metode yang masih  makro  dan  terbatas, sehingga teknik analisis biomolekuler menjadi satu pilihan yang  harus dilakukan  untuk mendukung obat tradisional menuju  evidence based medicine (EBM)Beberapa teknik analisis biomolekuler sudah  dilakukan  dibeberapa pusat penelitian dan Perguruan Tinggi, bahkan Laboratorium di kompleks Litbang Kesehatan sudah dilengkapi peralatan yang mutakhir  yang mampu menganalisis  secara  molekuler   ekspresi  protein, enzim  dan  sitokin-sitokin yang  di release dan disintesis  selama proses penyakit itu mulai  berlangsung dan menjadi  karakter spesifik dari suatu penyakit tersebut. Untuk  mendukung  obat tradisional menuju  evidence based medicine (EBM),   maka  animal research dan laboratories studies secara in vitro menggunakan kultur sel  menjadi jembatannya. Makalah ini akan menguraikan secara ringkas pengujian obat tradisional berbasis tanaman yang  secara empiris sudah dibuktikan mampu mengobati beberapa penyakit namun perlu dipelajari, namun masih perlu dilakukan penelitian-penelitian untuk menjawab   ” kenapa dapat  menyembuhkan ? ” dan  ”bagaimana kerjanya pada tingkat seluler dan molekuler ? ”  Hasil yang diperoleh dari penelitian ini membuka peluang yang lebih luas untuk mengembangkan penelitian selanjutnya  yang orisinil.

Dalam contoh kerangka konsep teori menggambarkan bagaimana kandungan tanaman yang berfungsi sebagai antioksidan mampu memperbaiki derajat insulitis tikus DM  tipe 1 yang disiapkan dengan memberikan paparan streptozotocin  yang sering disingkat dengan MLD-STZ ( Multi Low Dose –Streptozotocin ) dengan dosisi 20 mg/KgBB.

Penggunakan metode TUNEL dapat diketahui secara pasti sel beta pankreas yang mengalami apoptosis dari warna inti yang terlihat. Sel yang mengalami apoptosis intinya akan terlihat berwarna coklat dan bergranul karena fragmentasi DNA,  dengan melihat perbedaan warna inti dengan perbesaran kecil dapat dibedakan dan diketahui sel yang mengalami apoptosis. Metode TUNEL ini spesifik untuk mendeteksi apoptosis pada tiap sel dalam jaringan dengan prinsip imunohistokimia yang melabel terputusnya untai DNA. Selama apoptosis DNA yang beruntai ganda akan terfragmentasi menjadi untai tunggal mononucleosom atau oligonucleosome (nicks). Untai tunggal ini dapat diidentifikasi menggunakan label terminal 3’OH yang telah dimodifikasi nukleotidanya dalam reaksi enzimatis (Roche, 2004).

Untuk mempelajari mamfaat lain juga dapat dipakai melalui kultur sel yang mendapat paparan antioksidan sebagai pencegahan dan terapi kanker  berbasis pada fungsi enzim protein kinase C-a.

Enzim PKC diketahui berperan dalam proses proliferasi dan diferensiasi berbagai sel otot polos (Itoh et al, 2001; Skaletz-Rorowski et al, 1999). Kejadian ini dikontrol oleh mekanisme genetik sebagai rangsangan sinyal ekstraseluler spesifik, yakni growth factor atau mitogen. Jalur yang dilalui pada transduksi sinyal untuk proliferasi sel adalah melalui pengaktifan ras → raf-1 → MEK → ERK → transcriptional factor di dalam inti sel seperti terlihat pada Gambar 4.  ( Kazanietz & Blumberg, 1996; Skaletz-Rorowski et al, 1999; Schonwasser et al, 1998;          Mii et al, 1996). Dari  Gambar 5 terlihat bahwa aktifitas dan ekpresi enzim PKC dapat dipakai untuk mengamati  terjadinya  prolifersi dan diferensiasi otot polos akibat agen infeksi dan terapinya menggunakan bioaktif yang terkandung dalam tanaman obat.

Peran obat tradisional  berbasis tanaman  untuk  pengobatan dapat dipelajari  juga  melalui ekspresi protein  dari kultur sel atau hewan coba bahkan pada tingkat pemakaian pada manusia dengan metode  elektroforesis ( SDS-PAGE) 

Selain teknik tekni IHK, SDS-PAGE masih ada beberap cara yang dapat digunakan , iatu dot bol, wetern blot dan ELISA

Kesimpulan

Dari uraian di atas dapat disimpulkan keanekaragaman hayati tanaman tropika Indonesia  yang menjanjikan   untuk dikembangkan sebagai sumber obat tradisonal yang  potensial, namun masih  perlu kajian  lebih lanjut pada  tingkat seluler dan molekuler  agar dapat menjelaskan mekanisme kerja  dalam menghambat  terjadinya penyakit.  Selain itu  dapat digunakan  sebagai landasan pengembangan upaya pengobatan menggunakan bahan aktif  tanaman obat. 

sumber gambar dari ramuanjamu.com    

¹Faculty of  Mathematic and Natural Sciences , Brawijaya University and

 ²⁾  Medical Faculty , Brawijaya University

ABSTRACT

            Since the importance of anti-GAD65 assays to predict IDDM (Insulin Dependent Diabetes Mellitus), therefore we observed the possibility of getting the alternative reagents and method for faster, more accurate and low cost diagnostic. In this observe, normal rabbits induced by anti-GAD65 from rat’s antisera, to produce antibodies to anti-GAD65 (anti-GAD65 antibodies). Antibodies collected and purified by 50% SAS, then we conjugated the purified antibodies with Alkaline Phosphatase (AP). The result of dot blotting which use GAD enzyme from bovine brain as antigen and rabbit’s antibodies are able to recognize anti-GAD65 both from rat’s antisera and pre-diabetic patient’s sera. This evidence explain that there is a possibility to use GAD65 enzyme and anti-GAD65 antibodies conjugated AP as diagnostic reagent for IDDM prediction. GAD65 enzyme as diagnostic reagent has optimum sensitivity in 1/50 (enzyme : phosphate buffer) and anti-GAD antibodies conjugated AP has optimum sensitivity in 1/150 (antisera : TBS) as secondary antibodies.